La fluorescenza è un effetto fisico causato dall'emissione di energia luminosa quando una sostanza viene illuminata dalla luce o da altre forme di radiazione elettromagnetica. La microscopia a fluorescenza è un microscopio ottico che utilizza fluorescenza e fosforescenza in situ o in combinazione con riflessione e assorbimento per studiare le proprietà ottiche di oggetti organici e inorganici. La microscopia a fluorescenza aiuta a vedere più chiaramente le strutture subcellulari e interne degli oggetti. Fu scoperto all'inizio del XX secolo da August Köhler, Carl Reichert e Heinrich Lehmann.
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Comemicroscopia a fluorescenzalavori
Funzionamento della microscopia a fluorescenza
Componenti del microscopio a fluorescenza
1. Fluoroforo
2. Sorgente luminosa
3. Filtro di eccitazione
4. Specchio dicroico
5. Filtro di scarico
Vantaggi della microscopia a fluorescenza
Svantaggi della microscopia a fluorescenza
Usi della microscopia a fluorescenza
Come funziona la microscopia a fluorescenza
La microscopia a fluorescenza di solito funziona colorando la composizione e la struttura di un campione con coloranti. Questo perché la maggior parte dei componenti cellulari sono di natura incolore. Pertanto, non possono essere facilmente distinti l'uno dall'altro. I fluorofori o le molecole fluorescenti illuminate con luce a lunghezza d'onda corta o raggi elettromagnetici tendono a emettere luce. La luce emessa ha una lunghezza d'onda maggiore rispetto alla luce incidente. Tipicamente, la durata tra l'irradiazione e l'emissione viene misurata in nanosecondi e può essere facilmente ignorata. La luce emessa viene separata dalla luce incidente, che indica l'esatta posizione del fluoroforo. L'immagine del campione viene generata in base alla luce secondaria anziché alla luce incidente primaria.
Funzionamento della microscopia a fluorescenza
La microscopia a fluorescenza funziona in modo simile alla microscopia ottica. È costituito da una forte sorgente luminosa, uno speciale filtro passa-banda e un'etichetta fluorescente del campione. Il campione da studiare viene posto al microscopio. Sul campione viene illuminata una luce con una lunghezza d'onda sufficientemente corta da eccitare il fluoroforo. Con l'aiuto di una lente obiettiva, questa luce viene focalizzata sul campione. I raggi di eccitazione emessi dal campione vengono poi focalizzati sul rilevatore attraverso la lente dell'obiettivo. La maggior parte della luce di eccitazione viene trasmessa attraverso l'oggetto campione, mentre una parte viene riflessa e raggiunge il rilevatore.
Componenti del microscopio a fluorescenza
1. Fluoroforo
Un fluoroforo è un composto che emette luce quando eccitato da onde elettromagnetiche o luminose. È anche chiamato colorante fluorescente. I fluorofori sono costituiti fondamentalmente da una combinazione di gruppi aromatici o molecole planari/cicliche con vari legami π.
2. Sorgente luminosa
La sorgente luminosa è uno dei componenti più importanti di un microscopio a fluorescenza. Qui, le sorgenti luminose più comuni utilizzate per l'eccitazione includono laser, LED ad alta potenza, lampade ad arco allo xeno, lampade ai vapori di mercurio, ecc.
3. Filtro di eccitazione
I filtri di eccitazione utilizzati nella microscopia a fluorescenza sono in genere filtri passa-banda, che consentono segnali che rientrano in una larghezza di banda specifica rifiutando tutti gli altri segnali. Le lunghezze d'onda assorbite dal fluoroforo passano facilmente, mentre la radiazione ottica riflessa viene bloccata.
4. Specchio dicroico
Gli specchi dicroici agiscono come filtri a film sottile. Lo scopo principale di uno specchio dicroico è quello di far passare selettivamente la luce di una piccola gamma di colori riflettendo allo stesso tempo tutti gli altri colori. È noto anche come filtro colore preciso.
5. Filtro di scarico
Il filtro di emissione è un filtro passa-banda. I filtri di emissione funzionano in modo simile ai filtri di eccitazione. Irradia la luce emessa dal fluoroforo bloccando la luce di eccitazione.
Vantaggi della microscopia a fluorescenza
1. La sensibilità della microscopia a fluorescenza è molto elevata, pari a circa 50 molecole per micrometro cubo.
2. Con la microscopia a fluorescenza, diverse molecole possono essere tinte di colori diversi, consentendo agli utenti di visualizzare più molecole di una sostanza contemporaneamente.
3. I microscopi a fluorescenza sono più efficienti dei tradizionali microscopi ottici.
4. Può essere utilizzato per l'imaging in vivo e in vitro.
5. La microscopia a fluorescenza può separare le singole proteine con elevata precisione.
6. La microscopia a fluorescenza è più adatta per l'imaging e lo studio dei comportamenti dinamici esibiti dalle cellule viventi.
7. La microscopia a fluorescenza è in grado di produrre immagini chiare e ad alta risoluzione, migliorando così la ricerca.
8. Combina le proprietà di ingrandimento della microscopia ottica con la visualizzazione della fluorescenza.
9. La microscopia a fluorescenza può essere utilizzata per generare immagini ingrandite 3D del campione studiato.
Svantaggi della microscopia a fluorescenza
1. I composti fluorescenti o fluorofori presenti nella microscopia a fluorescenza tendono a perdere la capacità di emettere luce nel tempo quando eccitati a causa di un processo chiamato fotosbiancamento. Il fotosbiancamento si verifica tipicamente quando una molecola di fluoroforo viene danneggiata chimicamente a causa dell'eccitazione elettronica durante la fluorescenza.
2. Consente solo l'osservazione e lo studio di alcune strutture del campione che sono state evidenziate ed etichettate come fluorescenti.
3. Quando i materiali fluorescenti vengono irradiati dalla luce, le molecole fluorescenti spesso producono sostanze chimiche che portano ulteriormente alla fototossicità. Questo effetto fototossico distrugge le proprietà originali del campione osservato. La fototossicità delle radiazioni luminose a lunghezza d'onda corta è relativamente elevata.
4. La microscopia a fluorescenza non può fornire informazioni sul doppio strato lipidico, soprattutto per i SUV.
5. La microscopia a fluorescenza non può fornire alcuna osservazione conclusiva relativa al carattere del doppio strato o alla lamellarità delle vescicole.
6. L'aggiunta di sonde e coloranti spesso interferisce con le proprietà delle vescicole lipidiche, portando a un'interpretazione imprecisa dei dati e quindi distruggendo l'autenticità dell'esperimento.
7. La perossidazione lipidica indotta dalla luce può portare alla formazione di domini.
Usi della microscopia a fluorescenza
1. La microscopia a fluorescenza è ampiamente utilizzata per studiare la struttura interna dei campioni a livello microscopico con la massima qualità.
2. La microscopia a fluorescenza è la più adatta per lo studio di campioni biologici viventi.
3. Questo tipo di microscopio è spesso preferito quando si etichettano le strutture più interne di cellule o microrganismi.
4. Aiuta a misurare lo stato fisiologico delle cellule o dei campioni osservati.
